Mona Lisa är mycket lik renässansens många avbildningar av Jungfru Maria, som på den tiden sågs som ett ideal för kvinnlighet. Kvinnan sitter påfallande upprätt i en "pozzetto"-fåtölj med armarna i kors, ett tecken på hennes reserverade hållning. Hennes blick är fäst på betraktaren. 

Kvinnan framstår som levande i en ovanlig utsträckning, vilket Leonardo uppnådde genom sin metod att inte rita konturer (sfumato). Den mjuka övertoningen skapar en tvetydig stämning "huvudsakligen i två drag: mungiporna och ögonvrårna".

Detalj av bakgrunden (höger sida)

Skildringen av den sittande i trekvartsprofil liknar sena 1400-talsverk av Lorenzo di Credi och Agnolo di Domenico del Mazziere. Zöllner noterar att den porträtterades allmänna position kan spåras tillbaka till flamländska modeller och att "i synnerhet de vertikala kolumnskivorna på båda sidor av panelen hade föregångare i flamländsk porträttkonst.

"Woods-Marsden nämner Hans Memlings porträtt av Benedetto Portinari (1487) eller italienska imitationer som Sebastiano Mainardis hängande porträtt för användningen av en loggia, som har effekten av att medla mellan den porträtterade och det avlägsna landskapet, en egenskap som saknas i Leonardos tidigare porträtt av Ginevra de' Benci.

Av Leonardo da Vincis verk är Mona Lisa det enda porträtt vars äkthet aldrig på allvar har ifrågasatts, och ett av fyra verk - de andra är Sankt Hieronymus i vildmarken, Magiornas tillbedjan och Nattvarden - vars tillskrivning har undgått kontroverser. I oktober 1503 hade han börjat arbeta på ett porträtt av Lisa del Giocondo, modellen till Mona Lisa. Vissa tror att Mona Lisa påbörjades 1503 eller 1504 i Florens. 

Rafaels teckning (ca 1505), efter Leonardo; idag i Louvren tillsammans med Mona Lisa

Även om Louvren anger att den "utan tvekan målades mellan 1503 och 1506", säger konsthistorikern Martin Kemp att det finns vissa svårigheter med att bekräfta datumen med säkerhet. Alessandro Vezzosi anser att målningen är karakteristisk för Leonardos stil under de sista åren av hans liv, efter 1513. Andra akademiker hävdar att Leonardo, med tanke på den historiska dokumentationen, skulle ha målat verket från 1513. 

"La Joconde est Retrouvée"
13 december 1913

Enligt Vasari "lämnade [han] det oavslutat efter att ha funderat på det i fyra år". År 1516 inbjöds Leonardo av kung Frans I att arbeta på Clos Lucé nära Château d'Amboise; man tror att han tog Mona Lisa med sig och fortsatte att arbeta på den efter att han flyttat till Frankrike. Konsthistorikern Carmen C. Bambach har dragit slutsatsen att Leonardo förmodligen fortsatte att förfina verket fram till 1516 eller 1517. Leonardos högra hand var förlamad omkring 1517, vilket kan tyda på varför han lämnade Mona Lisa oavslutad.